微生物檢測:NGS和質譜為行業變革帶來契機
發布日期:
2019-07-15

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微生物檢測屬于IVD的一個細分領域,是對感染性疾病的病原體或代謝物進行檢測分析,在臨床上通常用于輔助診斷,判斷感染類型、指導用藥,鑒定環節越準確,診斷結果和治療方案選擇越恰當。如果沒有微生物檢測,醫生傾向于過度用藥,或重復試藥,可能導致微生物耐藥性或病情延誤。


微生物檢測主要用于輔助診斷,百億級市場市場空間,潛力很大


你可能知道,“抗生素濫用”在中國很普遍。改變這個現狀就要靠微生物檢測。2011年衛生部頒布了史上最苛刻的《抗菌藥物臨床管理辦法》,把微生物檢測的地位提到了前所未有的高度。


微生物檢測屬于IVD的一個細分領域,是對感染性疾病的病原體或代謝物進行檢測分析,在臨床上通常用于輔助診斷,判斷感染類型、指導用藥,鑒定環節越準確,診斷結果和治療方案選擇越恰當。如果沒有微生物檢測,醫生傾向于過度用藥,或重復試藥,可能導致微生物耐藥性或病情延誤。


我國醫療機構常規臨床微生物檢測項目有7類,152項,主要包括八大類:真菌、放線菌、螺旋體、細菌、立克次氏體、衣原體、病毒和支原體。其中細菌檢測81項,占比為52.5%。


傳統微生物檢測方法在檢測時間、可檢測的微生物數量、靈敏度等方面存在很多不足


目前,微生物實驗室使用的檢測產品大部分以傳統方法為基礎。傳統檢測方法分為染色法、培養法、非培養法三種。目前常用的方法為生化原理檢測,先判斷革蘭式陰性還是陽性,再根據形態、酶反應、顯色等不同方法,將具體微生物種類鑒定出來。


染色法、培養法是基于傳統的涂片鏡檢,在顯微鏡下觀察變化。培養法的技術是微生物培養、鑒定和藥敏檢測,也是微生物檢測技術中最為重要和成熟的部分。而非培養法是基于酶生化反應,利用微生物繁殖過程中產生的特異性酶與一顯色底物發生顯色反應而實現檢測,主要適用于細菌性陰道病檢測。


對于絕大多數的微生物檢測有一個繞不開的環節,那就是標本處理和培養。需要首先對樣本進行預處理,根據涂片染色的結果選擇合適的培養基分離培養。然后根據菌落特點,選擇適當的生化反應或者自動儀器鑒定。藥敏檢測則采用紙片法或直接上自動化儀器分析。


只有通過培養得到的各類致病菌,也就是陽性標本,才會做進一步的鑒定和藥敏檢測。在歐美細菌培養的陽性率在35%左右;根據《中國體外診斷產業發展藍皮書2015年》發布數據,我國陽性率比較低,只有20%-30%。


總結下來,傳統微生物檢測方法有三個方面的問題。一個是樣品培養導致檢測時間長,傳統生物檢測時間短到幾小時,長到幾天都有可能。二是鑒定出來的種類有限,準確度一般。上面已經說過的細菌培養陽性率很低,而且可培養的細菌數量只占病原微生物很小的比例。第三是流程較復雜,離不開人工干預,尤其是樣本處理和培養階段很難用自動化儀器取代。


基于NGS和質譜的微生物檢測技術為行業變革帶來契機


基于NGS與質譜技術的微生物檢測數據分析方法具有無需預先培養樣本、靈敏度高、能夠檢測未知的微生物的特點,為疾病防控和生物食品安全提供了新的解決方案。


二者有幾個明顯優勢:1、速度快,例如質譜的檢測時間以分鐘計,可實現高通量檢測。2、省去樣品培養環節,無法培養的微生物也可以檢測。目前最多均可檢測多達2000余種病原微生物,遠高于傳統的152種。 3、試劑耗材相對傳統使用較少,成本主要是測序儀、質譜儀設備投入。


不管是NGS還是臨床質譜檢測,臨床應用的探索與開發僅有十年左右。NGS龍頭Illumina于2010年推出Hiseq2000 奠定其行業領先地位,同年NIPT開始初步應用于臨床,至今NIPT仍然是NGS最成熟的商業化應用。而在臨床質譜領域,目前全球應用相對成熟的微生物鑒定,從開發至今也不到十年。


NGS和質譜的臨床應用均未被完全開發,未來仍有較強的平臺延展性。基因檢測通過對疾病的本質與起源進行檢測分析,獲得最精確的診斷結果和最合適的治療方案,臨床上可以用于婦幼、腫瘤、遺傳病等多個領域。而質譜可以直接對體內各種物質及其代謝產物進行定量檢測,全程對疾病的診斷、治療、預后進行監測,目前已經應用于婦幼、感染、遺傳病等領域。基因測序需要通過大數據分析獲得結果和疾病的相關性,而質譜需要的則是不斷完善數據庫,以提高檢測結果的準確性。


目前國內僅梅里埃和BD兩家外企,及北京毅新博創的微生物質譜獲得CFDA認可。雖然外企大范圍市場推廣時間較短(約2-3年),市場總裝機量不超過400臺,但是根據2016年檢驗醫學網的數據,2015年在細菌鑒定和藥敏檢測中,梅里埃的質譜儀已達到了2%的市占率,增長迅速。總體來看占據主導地位的還是梅里埃和西門子的傳統檢測系統,目前合并統計后生物梅里埃在細菌鑒定和藥敏檢測中市占率高達61.1%,西門子緊隨其后為26.7%。


質譜技術在臨床微生物菌種鑒定領域的應用,除了技術本身,更重要的是依賴于質譜菌種鑒定數據庫。因此,數據庫中圖譜的質量、數量都將直接影響鑒定的成功率與準確率。由于病原微生物分布流行情況不同,實驗室在原有數據庫基礎上可補充建立本地病原微生物的質譜指紋圖譜庫,提高鑒定成功率。


目前梅里埃和BD的產品均可以鑒定2000多種微生物,安圖生物在微生物檢測領域積累20多年,已開發出具有自主知識產權的中國本土化微生物菌株數據庫,可鑒定超過1500種微生物。


反觀NGS在微生物領域額應用,目前全球還沒有相關領域的注冊試劑獲批。國外是通過LDT的方式開展。國內目前處在方法學的標準品驗證階段。由中檢院負責,華大基因、博奧生物、達瑞生物和賽哲生物四家公司是第一批參與標準品驗證的行業玩家。其中華大基因用自己的BGISEQ測序平臺,博奧生物、達瑞生物兩家用Thermo Fisher的NGS平臺,賽哲生物用的是Illumina平臺。


所謂標準品是行業對NGS方法學,即測序平臺的驗證。由中檢院“出題”,構建一個由1000多種基因組成的樣品“黑箱”,四家受試者在各自的平臺上分析。檢測準確度達到一定標準的,就把這種檢測平臺作為方法學的標準品,后續可以在這個平臺上開發產品。毫無疑問,通過率先通過標準品驗證的公司會在行業建立先發優勢。


數據庫是微生物NGS、質譜檢測的核心壁壘


通過NGS或者質譜平臺拿到序列后,面臨的一個重要問題就是:選擇什么數據庫進行比對才能得到較好的分類鑒定結果呢?數據庫中圖譜的質量、數量都將直接影響鑒定的成功率與準確率。如原核的16S rDNA序列,真核的18S rDNA序列、ITS(ribosomalinternal transcribed spacer)序列等。


有兩個關于人體微生物組的奠基性研究,一個是人類腸道宏基因組計劃 MetaHIT,由歐盟發起,8個國家14個研究機構參與。華大基因承擔了其中關鍵的測序與分析工作,從2008年1月1日到2012年6月30日,構建了第一個腸道微生物基因集,包含330萬個基因,是近年來腸道微生物研究的里程碑。另一個是由美國國家衛生院發起的人類微生物組計劃。從2008年到2013年,采集了人體各個部位共超過5000份樣本進行了測序和深入的分析,繪制了人體相關的微生物圖譜,并破解了3000種微生物前基因組,初步建立了人體共生微生物參考數據庫。


其實針對每一類生物的主要marker序列都有相應的數據庫以方便比對鑒定。如 RDP數據庫(RibosomalDatabase Project)、SILVA數據庫(一個包含細菌、古菌、真核rRNA基因序列的綜合數據庫)、Greengenes(針對細菌、古菌16S rRNA基因)數據庫、 PR2(ProtistRibosomal Referencedatabase)數據庫(針對真核微生物18SrRNA基因)等等。


由于病原微生物分布流行情況不同,這些公開數據庫不能完全滿足臨床檢測需求。實驗室在原有數據庫基礎上需補充建立本地病原微生物的質譜指紋圖譜庫,提高鑒定成功率。


文章來源:轉化醫學網